Responsabile di Progetto: Laura Pastorino

Dipartimento: DIBRIS, Dipartimento di informatica, bioingegneria, robotica e ingegneria dei sistemi

Obiettivo del progetto

Il progetto si basa, sull’utilizzo innovativo del biopolimero chitosano per lo sviluppo di formulazioni da usare:

1. come fattore di adesione e di supporto per la preparazione e la crescita di colture neuronali 2D, in alternativa ai fattori di adesione standard (oggetto del brevetto)
2. come componente principale di scaffold 3D per sostenere la crescita di reti neuronali attive, e sviluppare così piattaforme biomimetiche di screening farmacologico per malattie neurodegenerative

L’obiettivo finale è quello sviluppare modelli neuronali in vitro 2D e 3D utilizzando come materiale di sostegno e crescita il chitosano, al fine di semplificare ed ottimizzare la caratterizzazione ed il confronto dei dati ottenuti dalle 2 diverse configurazioni. Infatti, l’utilizzo dello stesso materiale, sia per la coltura 2D e 3D, rappresenta un’importante aspetto da non sottovalutare in termini di maggiore robustezza e riproducibilità dei risultati sperimentali. In questo modo, infatti, risulta possibile il confronto tra il comportamento della cellula nelle due configurazioni, eliminando gli artefatti di natura chimica che l’utilizzo di diversi materiali potrebbe introdurre.

1. prototipi realizzati saranno utilizzati sia con cellule animali, che rappresentano il modello di riferimento negli studi elettrofisiologici di colture neuronali, sia con cellule staminali umane. Quest’ultimo approccio si inserisce nello spirito della direttiva 2010/63/EU e del DL 26/2014 sulla protezione degli animali da laboratorio, promuovendo la riduzione e/o sostituzione della sperimentazione animale, anche per via della crescente consapevolezza di come un modello animale resti una rappresentazione imperfetta del sistema umano. Studi di caratterizzazione morfologica e funzionale verranno condotti al fine di verificare come le formulazioni proposte possano sostituire i fattori di adesione commerciali, consentendo un risparmio in termini di tempistiche di preparazione e di costi. Il piano di testing ha l’obiettivo di verificare che le cellule cresciute sui modelli proposti mostrino un comportamento almeno paragonabile a quello ottenuto sui prodotti commerciali. Verrà anche sviluppata una formulazione da impiegare per creare dei pattern. I pattern 2D sono substrati che seguono geometrie definite che guidano l’adesione e la crescita del neurone esclusivamente sulle aree definita dal materiale, permettendo lo sviluppo di reti neuronali 2D organizzate, utili per specifici studi funzionali.

Gli scaffold 3D verranno caratterizzati morfologicamente e meccanicamente, al fine di valutare la porosità, le proprietà meccaniche e l’iniettabilità, per validarlo come possibile bioinchiostro da utilizzare con stampanti 3D commerciali.

Infine, entrambi i modelli 2D e 3D verranno caratterizzati in condizioni dinamiche all’interno di bioreattori, sottoponendoli a condizioni di stress simili all’ in vivo.

Brevetto di riferimento

PCT/IB2019/060467, “Procedimento e sistema per il trattamento delle superfici di supporti o contenitori per colture cellulari neuronali bidimensionali mediante chitosano quale fattore di adesione cellulare.”

Breve descrizione del problema che la tecnologia risolve

Studi recenti stimano che la popolazione over 65 triplicherà entro il 2050. Questo avrà un impatto forte sul sistema sanitario, dato il possibile incremento dell’incidenza delle patologie neurodegenerative (Alzheimer, Parkinson, Demenza senile), per cui l’età avanzata rappresenta il maggior fattore di rischio. Sarà quindi fondamentale avere degli strumenti efficaci ed affidabili per uno screening rapido ed economico di molecole candidate al trattamento di queste patologie in fase preclinica. D’altra parte, è riconosciuto come il 25% dei farmaci non superino i trials clinici perché tossici per l’uomo. Per questo motivo, ottenere modelli in vitro avanzati per effettuare screening farmacologici veloci, affidabili e che riproducano in modo più fedele le caratteristiche morfologiche e funzionali del tessuto umano in vivo, rappresenta l’obiettivo principale della ricerca scientifica in questo campo.

A questo scopo, lo sviluppo di modelli 3D in vitro si sta affermando come un valido strumento per riprodurre il comportamento delle cellule in vivo. Inoltre, lo sviluppo di piattaforme per screening farmacologici è un tema fondamentale per la neurobiologia, poiché ad oggi non esistono modelli 3D specifici per il sistema nervoso.

I modelli 2D, però, restano un passaggio fondamentale per ottenere informazioni di controllo sulla vitalità cellulare, e rappresentano ancora il gold standard di molta ricerca scientifica. I modelli 2D permettono di osservare la risposta cellulare agli agenti farmacologici in maniera più veloce e consentono un’importante analisi preliminare sull’effetto che questi agenti possono avere rispetto a target specifici.

Ad oggi, la classica coltura 2D si basa sull’uso di polimeri di sintesi o proteine, che hanno spesso costi elevati per l’utilizzatore finale e protocolli di preparazione lunghi e delicati. Il chitosano è un materiale di origine naturale facilmente reperibile ed in grande quantità. La fabbricazione dei modelli 2D consiste nella deposizione di strati nanometrici di chitosano, tramite l’impiego di uno spruzzatore, sulle superfici di interesse.

I modelli 3D al momento in via di sviluppo sono:

• hydrogels in forma forma di microsfere per fabbricazione di strutture modulari
• soluzioni gelificanti a temperatura fisiologica (thermogels) per formulazioni iniettabili in vivo. Da nostre evidenze sperimentali, i protocolli di lavorazione del chitosano non presentano particolari criticità e risultano facilmente scalabili a livello industriale, al fine di commercializzare Kit pronti all’uso per culture neuronali 2D e 3D.

In conclusione, i punti di forza che ottimizzerebbero i prodotti ad oggi in uso sono:

• Semplicità, velocità e basso rischio connesso allo sviluppo ed utilizzo delle invenzioni d’uso
• Bassi costi di prototipazione e produzione di Kit specifici per culture neuronali 2D e 3D ad oggi non esistenti
• Versatilità dei prodotti proposti (ad esempio offrendo Kit 2D con geometrie ad hoc tramite maschere micro-lavorate con pattern specifici)
• Sviluppo di piattaforme per studi di neurotossicità tramite funzionalizzazione del chitosano con molecole bioattive che abbiano interazione specifica con il farmaco da testare

Settori di potenziale applicazione della tecnologia sviluppata (diretti e indiretti)

I potenziali utilizzatori di questi modelli sono i laboratori di ricerca universitari, i centri di ricerca pubblici e privati, le aziende farmaceutiche, che trarrebbero un sicuro vantaggio in termini di velocità e solidità dei risultati, traducibile conseguentemente in un vantaggio economico.

Descrizione progressiva delle attività e dei risultati conseguiti rispetto agli obiettivi

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Immagini

Figura 1.  A) Pattern a griglia ottenuto con la soluzione di chitosano. B) Rete neuronale su pattern a griglia a DIV14, marcate con MAP2 (verde), DAPI(blu). Scale bar: 200 µm.

Figura 2. A) Test di gelificazione qualitativa della formulazione a base di chitosano prima e dopo l’esposizione a temperatura fisiologica (37°C). Morfologia interna dello scaffold 3D, ottenuto con la formulazione a base di chitosano, caratterizzata mediante microscopia a scansione elettronica. Scale bar: 20 µm.

Referente per richiesta contatti/informazioni

Laura Pastorino

Settore valorizzazione della ricerca e trasferimento tecnologico